Cellule senescenti: quali farmaci le eliminano davvero (e perché alcune sopravvivono)

La senescenza cellulare è una forma stabile di arresto del ciclo cellulare innescata da stress potenzialmente oncogeni (erosione dei telomeri, stress ossidativo, radiazioni o attivazione di oncogeni). Se da un lato questo meccanismo impedisce la proliferazione di cellule a rischio di trasformazione maligna, dall'altro le cellule senescenti esercitano effetti dannosi attraverso la secrezione di fattori pro-infiammatori noti collettivamente come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), in grado di favorire disfunzione tissutale e progressione di malattia a seconda del contesto biologico.

L'eliminazione mirata delle cellule senescenti mediante farmaci "senolitici" è emersa negli ultimi anni come strategia terapeutica promettente. Nel corso dell'ultimo decennio sono stati identificati oltre 20 candidati senolitici con meccanismi d'azione molto diversi tra loro. Tuttavia, fino a oggi non era mai stata condotta una comparazione sistematica testa a testa della loro efficacia e specificità. Uno studio pubblicato su Nature Aging (Wakita et al., 2026) ha colmato questa lacuna, confrontando 21 agenti senolitici con un approccio quantitativo rigoroso e identificando nel controllo della qualità mitocondriale il principale determinante della resistenza alla senolisi.

Confronto sistematico di 21 farmaci senolitici

I ricercatori hanno valutato l'attività di 21 composti (tra cui ABT199, ABT263, ABT737, ARV825, BPTES, CB839, dasatinib e quercetina, digossina, fisetina, gingerenone A, IMP1088, JQ1, nintedanib, OTX015, PCC1, PCLX-001, P5091, RG7112, R406, 17-DMAG e 25-idrossicolesterolo) su due modelli cellulari: i fibroblasti diploidi umani IMR-90 (senescenza replicativa) e le cellule epiteliali RPE-1 (senescenza indotta da doxorubicina).

Per quantificare la specificità di ciascun composto è stato introdotto un indice originale, il Senolytic Specificity Index (SSI), definito come il rapporto tra la percentuale di riduzione delle cellule senescenti al giorno 3 rispetto al giorno 0 e la percentuale di riduzione delle cellule di controllo al giorno 2 rispetto al controllo non trattato. Un SSI più elevato indica una maggiore selettività verso le cellule senescenti con minori effetti sulle cellule non senescenti.

Sebbene la maggior parte dei composti abbia mostrato una qualche attività senolitica, solo due si sono distinti in modo netto: l'inibitore della famiglia Bcl-2 ABT263 (navitoclax) e l'inibitore BET ARV825, che hanno raggiunto i valori di SSI più elevati in modo coerente sia nei fibroblasti IMR-90 che nelle cellule epiteliali RPE-1 e in altri modelli cellulari testati (TIG-1, TIG-3, senescenza indotta da etoposide). Risultati analoghi sono stati ottenuti con il metodo di colorazione con Annexin V, che ha evidenziato risposte apoptotiche nella maggior parte dei composti nelle cellule di controllo, con l'eccezione notevole di ABT263, ARV825, ABT199, ABT737, digossina e OTX015. ABT737 ha anch'esso mostrato elevata efficacia, ma ABT263 e ARV825 si sono confermati i candidati più promettenti nei modelli esaminati.

Un dato rilevante emerso da questi esperimenti è che nemmeno i senolitici più potenti sono in grado di eliminare completamente le cellule senescenti: anche con trattamenti prolungati fino a 7 giorni, una quota di circa il 20-30% delle cellule senescenti rimaneva vitale.

Il ruolo della V-ATPasi nella resistenza alla senolisi

Per comprendere i meccanismi alla base di questa resistenza, i ricercatori hanno analizzato le caratteristiche della popolazione sopravvissuta mediante RNA-sequencing (RNA-seq) e single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). L'analisi dei geni differenzialmente espressi nelle cellule senescenti resistenti ad ABT263 o ARV825 ha rivelato 51 geni sovraregolati e 71 sottoespressi in comune. L'analisi Gene Ontology ha mostrato che molti geni sovraregolati codificano fattori SASP, suggerendo che le cellule senescenti persistenti mantengono e anzi amplificano il loro profilo secretorio infiammatorio, con potenziali ripercussioni negative sull'efficacia terapeutica.

L'analisi scRNA-seq ha identificato come i geni più frequentemente espressi nelle cellule resistenti ad entrambi i farmaci le subunità della V-ATPasi (in particolare ATP6V0E1), enzima vacuolare essenziale per la clearance lisosomiale dei mitocondri danneggiati (mitofagia). Attraverso esperimenti di knockdown con siRNA, il silenziamento di ATP6V0E1 ha significativamente ridotto il potenziale di membrana mitocondriale e la sopravvivenza cellulare nelle cellule trattate con ABT263, mentre il trattamento con EN6 (attivatore della V-ATPasi) ha prodotto l'effetto opposto, proteggendo le cellule senescenti dalla senolisi.

La doppia colorazione con MT-1 (indicatore del potenziale di membrana mitocondriale) e ATP6V0E1 ha rivelato che le cellule senescenti sono eterogenee per entrambi i segnali. Dopo trattamento con ABT263 o ARV825, le cellule con bassa espressione di ATP6V0E1 diventavano positive all'Annexin V (segnale di apoptosi precoce) nei primi giorni, scomparendo entro il giorno 7. Al contrario, le cellule sopravvissute al giorno 7 mostravano una forte correlazione positiva tra intensità del segnale MT-1 e livelli di ATP6V0E1, con bassi livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Le cellule con bassa espressione di V-ATPasi non riescono a rimuovere i mitocondri danneggiati, accumulano ROS e muoiono; quelle con alta espressione di V-ATPasi eliminano i mitocondri compromessi in modo efficiente, mantengono l'integrità mitocondriale e sopravvivono.

Meccanismo d'azione di ARV825 e la via BRD4-XRCC4

Per quanto riguarda ARV825, il suo principale bersaglio BRD4 (proteina epigenetica della famiglia BET) è noto per regolare l'espressione genica mitocondriale, ma i ricercatori non hanno osservato effetti rilevanti in questa direzione nei fibroblasti senescenti. Hanno invece dimostrato che ARV825 riduce i livelli di XRCC4, una proteina coinvolta nel riparo del DNA per via del non-homologous end joining (NHEJ) attraverso la downregolazione di BRD4. In modo inaspettato, XRCC4 è risultato co-localizzare con i mitocondri nelle cellule senescenti, dove si lega alla DNA ligasi III (che condivide similarità strutturale con la DNA ligasi IV). Il knockdown di XRCC4 e della DNA ligasi III ha riprodotto fedelmente gli effetti di ARV825 e ABT263 sulla funzione mitocondriale e sulla morte cellulare senescente, confermando che ARV825 promuove la morte delle cellule senescenti (almeno in parte) compromettendo la funzione mitocondriale attraverso l'asse BRD4-XRCC4.

Lo stress metabolico mitocondriale potenzia la senolisi

Partendo dall'ipotesi che aumentare il carico di lavoro mitocondriale possa rendere le cellule senescenti più vulnerabili ad ABT263 e ARV825, i ricercatori hanno esplorato la possibilità di indurre uno shift metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Le cellule senescenti sono note per accelerare la glicolisi e mantenere l'omeostasi redox; forzarle verso la dipendenza da OXPHOS incrementa il carico mitocondriale e lo stress ossidativo.

A tale scopo è stato impiegato BAY876, un inibitore altamente selettivo del trasportatore del glucosio GLUT1, che sopprime la glicolisi e induce uno shift compensatorio verso OXPHOS, con aumento dell'attività del ciclo TCA e del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Il trattamento combinato di BAY876 con ABT263 o ARV825 nelle cellule senescenti TIG-3 ha prodotto una significativa riduzione del potenziale di membrana mitocondriale e un aumento dei livelli di ROS, senza effetti rilevanti sulle cellule di controllo non senescenti. L'efficienza di morte delle cellule senescenti è risultata notevolmente potenziata dalla co-somministrazione con BAY876, e risultati analoghi sono stati ottenuti in altri tipi cellulari.

Validazione in modelli animali: dieta chetogenica e inibitori SGLT2

La validazione in vivo è stata condotta su modelli murini. Le cellule senescenti sono note per promuovere la crescita tumorale e la metastasi attraverso la secrezione di fattori SASP; in particolare, le cellule di melanoma B16 trapiantate per via endovenosa si accumulano preferenzialmente nei polmoni di topi anziani, dove le cellule senescenti sono più abbondanti.

I ricercatori hanno somministrato a topi anziani (87 settimane) ABT263 o ARV825 in combinazione con una dieta chetogenica (90% calorie da grassi, 10% da proteine, 0% da carboidrati) oppure con la sola dieta standard. Per escludere effetti diretti dei farmaci o della dieta sulle cellule tumorali, entrambi gli interventi sono stati sospesi 3 settimane prima del trapianto delle cellule B16. I risultati hanno mostrato che nei topi con dieta normale i farmaci senolitici riducevano le cellule p16^INK4a^-positive e p21^WAF1/CIP1^-positive nei polmoni e tendevano a ridurre l'accumulo di cellule B16; questi effetti erano significativamente più pronunciati nei topi alimentati con dieta chetogenica. Nei topi che ricevevano sia la dieta chetogenica che il farmaco senolitico si osservava anche una riduzione sostanziale dell'espressione di Cxcl2 e Cxcl12, geni SASP noti per favorire la migrazione delle cellule B16.

In un secondo modello, utilizzando cellule tumorali HCT116 di carcinoma colorettale in xenograft su topi nudi trattati con doxorubicina (per indurre senescenza terapeutica), l'utilizzo della dieta chetogenica ha causato mortalità elevata, verosimilmente per il rischio di chetoacidosi in condizioni di stress metabolico, portando i ricercatori a testare in alternativa il dapagliflozin, un inibitore del cotrasportatore sodio-glucosio 2 (SGLT2), che riduce la glicemia bloccando il riassorbimento renale del glucosio. La somministrazione di dapagliflozin ha ridotto la glicemia senza causare mortalità. La combinazione di SGLT2 inibitore con ARV825 o ABT263 ha prodotto un'inibizione della crescita tumorale significativamente più potente rispetto ai singoli trattamenti, con riduzione delle cellule senescenti intratumorali p21^WAF1/CIP1^-positive e 53BP1-positive Ki67-negative e aumento dei marcatori di ROS e apoptosi.

Implicazioni e limitazioni dello studio

Lo studio dimostra che l'eterogeneità delle cellule senescenti (in particolare la variabilità nell'espressione della V-ATPasi e nella qualità mitocondriale) è un determinante chiave della resistenza alla senolisi. Le cellule senescenti che mantengono un'elevata espressione di V-ATPasi riescono a eliminare i mitocondri danneggiati e a prevenire l'accumulo di ROS, sfuggendo così agli effetti pro-apoptotici di ABT263 e ARV825. Interventi metabolici già disponibili in clinica (come la dieta chetogenica o gli inibitori SGLT2) aumentano il carico di lavoro mitocondriale e inducono stress mitocondriale, potenziando l'efficacia senolitica di questi farmaci in vivo. Gli autori sottolineano tuttavia che gli esperimenti in vivo sono stati condotti esclusivamente su topi maschi, il che limita la generalizzabilità dei risultati al sesso femminile. Rimane inoltre aperta la possibilità che parte degli effetti antitumorali osservati coinvolga meccanismi indipendenti dalla senolisi.

Link all'articolo: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41611832/